Tinciones de microorganismos
Examen por tinción
Las técnicas
de coloración son imprescindibles para el estudio microscópico de las muestras
y de los propios microorganismos, pues permiten observar con detalle la
morfología bacteriana y proporcionan información complementaria sobre su
comportamiento frente a determinados colorantes, lo cual posibilita su
diferenciación. Las preparaciones teñidas se visualizan al microscopio con el
condensador alto y objetivo de inmersión de gran aumento (100x).
Una vez
realizado el frotis y la fijación, se procede a aplicar el o los colorantes
según sea la tinción. En bacteriología se utilizan tres clases de tinciones:
a) Tinción
simple
b) Tinción
diferencial
c) Tinciones especiales.
1. Tinción
simple: es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante y sirve para
observar tamaño y forma celular. Las más comunes son la de azul de metileno,
carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
2. Tinciones
diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su
reacción con los colorantes utilizados. Entre ellos la tinción de Gram.
3.
Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el
exterior de la célula bacteriana, inclusiones citoplasmáticas como también
algunos microorganismos que dadas sus características especiales no se tiñen
adecuadamente con técnicas rutinarias.
Reactivos
Los colorantes
que se utilizan preferentemente son los básicos o nucleares derivados de la
anilina (fuchina, cristal violeta, violeta de genciana, azul de metileno),
debido a que el citoplasma bacteriano es muy basófilo por ser rico en ARN.
Estos colorantes se presentan generalmente asociados a un mordiente (ácido
fénico) para reforzar su acción, aunque algunas técnicas de tinción aplican,
además, otro mordiente suplementario (solución yodo-yodurada o lugol en la
tinción de Gram). Las técnicas pueden emplear un solo colorante (tinciones
simples o sencillas) o dos, uno de ellos de base y otro de contraste (tinciones
diferenciales o compuestas), para poner de manifiesto el distinto
comportamiento tintorial de los microorganismos. Los colorantes de contraste
suelen ser citoplasmáticos o ácidos (eosina, ácido pícrico).
Tinción
diferencial de gram
La coloración
de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciación morfológica y
taxonómica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos
según retengan o no el colorante de base usado en la tinción, que es el violeta
de genciana o el cristal violeta:
-Las bacterias
grampositivas aparecen con el citoplasma teñido uniformemente de color azul o
violeta.
-Las bacterias
gramnegativas se tiñen de rojo por el colorante usado como contrastador
(fuchina, safranina).
La diferencia
entre unas y otras radica en la composición química de la pared celular y su
permeabilidad. La pared de las gramnegativas es más delgada y presenta un
contenido lipídico diez veces mayor que el de las grampositivas, lo cual
dificulta la tinción y la retención del colorante en el citoplasma.
Las técnicas de tinción varian según cada autor:
1.
Violeta de genciana o cristal violeta por 2 minutos.
2.
Lavar con agua destilada.
3.
Solución mordiente de lugol por 1 minuto.
4.
Alcohol acetona al 30% o alcohol etilico por 30 segundos.
5.
Lavar con agua destilada abundantemente.
6.
Fuchina diluida al 5% o safranina por 1 minuto.
7.
Lavar con agua destilada.
8.
Dejar secar al aire.
Tinción de Ziehl- Neelsen
Es el procedimiento empleado para colorear aquellas bacterias que son
difíciles de teñir con los colorantes básicos, porque se muestran impermeables
a la coloración. Solamente utilizando colorantes enérgicos como la fuchina
fenicada, y forzando su acción mediante la aplicación de calor o prolongando el
tiempo de contacto, estas bacterias logran retener el colorante. Y lo hacen de
tal manera, que los colorantes fuertes como el alcohol y los ácidos no
consiguen decolorarlas. Por eso se les llama bacterias ácido-alcohol
resistentes (BAAR).
1.
Cubrir el frostis con un papel de filtro para evitar la
precipitación del colorante.
2.
Añadir fuchina fenicada.
3.
Calentar suavemente con una llama de alcohol hasta emisión de
vapores.
4.
Repetir la operación dos veces más, pasados unos minutos,
hasta contabilizar un tiempo total de actuación del colorante de 8-10 minutos.
5.
Lavar con agua destilada en abundancia.
6.
Decolorar intensamente con alcohol clorhídrico al 3%.
7.
Lavar con agua destilada.
8.
Añadir azul de metileno o verde de malaquita y dejar actuar
durante un minuto.
9.
Lavar con agua destilada.
10.
Dejar secar al aire.
Tinción de Giemsa
Se utiliza principalmente para tinción de rickettsias, chlamydias,
protozoos (Plasmodium, Pneumocystis) y ciertos hongos (Histoplasma), aparte de
ser muy eficaz para diferenciar células. Con este mismo fin se puede utilizar
la tinción de Wright (eosina).
La fijación del frotis se realiza con metanol durante 3-5 minutos para no
deteriorar las células; una variante de la técnica de Giemsa emplea como fijador
el reactivo de May Grunwald-Giemsa que además de fijar facilita la coloración.
Existen muchas modalidades diferentes de realizar la técnica. Una de ellas es
la siguiente:
1.
Colorante de Giemsa por 8 minutos.
2.
Lavar con agua destilada.
3.
Dejar secar al aire.
Tinciones especiales
Ciertas técnicas especiales de coloración, de ejecución bastante
complicada, permiten precisar algunos detalles sobre la estructura bacteriana.
Con ellas se puede colorear:
-El componente nuclear (tinción de Piekarski-Robinow, Piechaud), difícil
de evidenciar.
-Los cilios o flagelos (tinción de Leifson, Fontana- Tribondeau). También
útiles para teñir treponemas.
-La cápsula (tinción de Hiss, Borrel).
-Las granulaciones metacromáticas (tinción de Albert, Ernst-Neisser, negro
Sudán).
-Las esporas (tinción de Moeller, Wirtz- Conklin).
La evidencia de algunas de estas estructuras no tiene más que un interés
teórico o de investigación, pero escasa utilidad en el laboratorio clínico.
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