Tinciones de microorganismos

Examen por tinción
Las técnicas de coloración son imprescindibles para el estudio microscópico de las muestras y de los propios microorganismos, pues permiten observar con detalle la morfología bacteriana y proporcionan información complementaria sobre su comportamiento frente a determinados colorantes, lo cual posibilita su diferenciación. Las preparaciones teñidas se visualizan al microscopio con el condensador alto y objetivo de inmersión de gran aumento (100x).

Una vez realizado el frotis y la fijación, se procede a aplicar el o los colorantes según sea la tinción. En bacteriología se utilizan tres clases de tinciones:
a) Tinción simple
b) Tinción diferencial
 c) Tinciones especiales.
1. Tinción simple: es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante y sirve para observar tamaño y forma celular. Las más comunes son la de azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina.
2. Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reacción con los colorantes utilizados. Entre ellos la tinción de Gram.
3. Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la célula bacteriana, inclusiones citoplasmáticas como también algunos microorganismos que dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias.
Reactivos
Los colorantes que se utilizan preferentemente son los básicos o nucleares derivados de la anilina (fuchina, cristal violeta, violeta de genciana, azul de metileno), debido a que el citoplasma bacteriano es muy basófilo por ser rico en ARN. Estos colorantes se presentan generalmente asociados a un mordiente (ácido fénico) para reforzar su acción, aunque algunas técnicas de tinción aplican, además, otro mordiente suplementario (solución yodo-yodurada o lugol en la tinción de Gram). Las técnicas pueden emplear un solo colorante (tinciones simples o sencillas) o dos, uno de ellos de base y otro de contraste (tinciones diferenciales o compuestas), para poner de manifiesto el distinto comportamiento tintorial de los microorganismos. Los colorantes de contraste suelen ser citoplasmáticos o ácidos (eosina, ácido pícrico).
Tinción diferencial de gram
La coloración de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciación morfológica y taxonómica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos según retengan o no el colorante de base usado en la tinción, que es el violeta de genciana o el cristal violeta:
-Las bacterias grampositivas aparecen con el citoplasma teñido uniformemente de color azul o violeta.
-Las bacterias gramnegativas se tiñen de rojo por el colorante usado como contrastador (fuchina, safranina).
La diferencia entre unas y otras radica en la composición química de la pared celular y su permeabilidad. La pared de las gramnegativas es más delgada y presenta un contenido lipídico diez veces mayor que el de las grampositivas, lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante en el citoplasma.
Las técnicas de tinción varian según cada autor:
1.    Violeta de genciana o cristal violeta por 2 minutos.
2.    Lavar con agua destilada.
3.    Solución mordiente de lugol por 1 minuto.
4.    Alcohol acetona al 30% o alcohol etilico por 30 segundos.
5.    Lavar con agua destilada abundantemente.
6.    Fuchina diluida al 5% o safranina por 1 minuto.
7.    Lavar con agua destilada.
8.    Dejar secar al aire.

Tinción de Ziehl- Neelsen
Es el procedimiento empleado para colorear aquellas bacterias que son difíciles de teñir con los colorantes básicos, porque se muestran impermeables a la coloración. Solamente utilizando colorantes enérgicos como la fuchina fenicada, y forzando su acción mediante la aplicación de calor o prolongando el tiempo de contacto, estas bacterias logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que los colorantes fuertes como el alcohol y los ácidos no consiguen decolorarlas. Por eso se les llama bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR).

1.    Cubrir el frostis con un papel de filtro para evitar la precipitación del colorante.
2.    Añadir fuchina fenicada.
3.    Calentar suavemente con una llama de alcohol hasta emisión de vapores.
4.    Repetir la operación dos veces más, pasados unos minutos, hasta contabilizar un tiempo total de actuación del colorante de 8-10 minutos.
5.    Lavar con agua destilada en abundancia.
6.    Decolorar intensamente con alcohol clorhídrico al 3%.
7.    Lavar con agua destilada.
8.    Añadir azul de metileno o verde de malaquita y dejar actuar durante un minuto.
9.    Lavar con agua destilada.
10.  Dejar secar al aire.
Tinción de Giemsa
Se utiliza principalmente para tinción de rickettsias, chlamydias, protozoos (Plasmodium, Pneumocystis) y ciertos hongos (Histoplasma), aparte de ser muy eficaz para diferenciar células. Con este mismo fin se puede utilizar la tinción de Wright (eosina).
La fijación del frotis se realiza con metanol durante 3-5 minutos para no deteriorar las células; una variante de la técnica de Giemsa emplea como fijador el reactivo de May Grunwald-Giemsa que además de fijar facilita la coloración. Existen muchas modalidades diferentes de realizar la técnica. Una de ellas es la siguiente:
1.    Colorante de Giemsa por 8 minutos.
2.    Lavar con agua destilada.
3.    Dejar secar al aire.



Tinciones especiales
Ciertas técnicas especiales de coloración, de ejecución bastante complicada, permiten precisar algunos detalles sobre la estructura bacteriana. Con ellas se puede colorear:
-El componente nuclear (tinción de Piekarski-Robinow, Piechaud), difícil de evidenciar.
-Los cilios o flagelos (tinción de Leifson, Fontana- Tribondeau). También útiles para teñir treponemas.
-La cápsula (tinción de Hiss, Borrel).
-Las granulaciones metacromáticas (tinción de Albert, Ernst-Neisser, negro Sudán).
-Las esporas (tinción de Moeller, Wirtz- Conklin).

La evidencia de algunas de estas estructuras no tiene más que un interés teórico o de investigación, pero escasa utilidad en el laboratorio clínico. 

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